لا تزال الأمراض الوراثية تشكل تحديًا عالميًا، إذ تنتج عن طفرات في الجينات تؤثر على الوظائف البيولوجية، أو العمليات الأيضية، أو إنتاج بروتينات أساسية معينة لدى الأفراد، مما يؤدي إلى اضطرابات وراثية مختلفة. أدوية العلاج الجيني هي نوع من التدخل العلاجي الذي يستهدف جينات معينة، بهدف إصلاحها أو تعديلها، وتوفير تعليمات جديدة للخلايا لإنتاج بروتينات وظيفية أو التدخل في العيوب الجينية المسببة للأمراض.
تشتمل الأدوية الجينية الشائعة بشكل أساسي على DNA وRNA، حيث يمكن أن يكون DNA عبارة عن أجزاء جينية أو تسلسلات جينية ذات تأثيرات علاجية. يتم تسليم هذا الحمض النووي إلى الخلايا ليحل محل أو يكمل وظائف الجينات المعيبة أو المفقودة. يمكن أن يكون الحمض النووي الريبي (RNA) عبارة عن RNA المرسال (mRNA)، أو RNA المتداخل الصغير (siRNA)، أو أليغنوكليوتيدات مضادة للتحسس (ASO)، وما إلى ذلك، والتي يمكن استخدامها لتعديل أو منع التعبير عن الجينات الضارة أو استعادة وظيفة جينات معينة.
ومع ذلك، يواجه كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي (RNA) العديد من التحديات بدءًا من دخول جسم الإنسان وحتى الوصول إلى الخلايا المستهدفة. نظرًا لأن تسلسل الجينات غير مستقر في الجهاز الهضمي، فعادةً ما يتم إعطاؤه عن طريق الحقن في الوريد أو تحت الجلد، ولكن حتى مع ذلك، لا تزال معظم تسلسلات الجينات متحللة بسبب وفرة النيوكلياز في جسم الإنسان.
عندما تصل كمية صغيرة من الأدوية الجينية المتبقية إلى خارج الخلايا المستهدفة، فإنها لا تستطيع دخول الخلايا لأن تسلسل الجينات عبارة عن جزيئات كبيرة بها مجموعات فوسفات تحمل شحنات سالبة، بينما تحمل أغشية الخلايا أيضًا شحنات سالبة. عند التقاء شحنتين سالبتين، تتنافر الجينات ولا تتمكن من دخول الخلايا. لذلك، نحن بحاجة إلى تطوير طرق محددة لتوصيل الأدوية الجينية لمنع تدهورها في الجسم الحي وتحسين كفاءة اختراق غشاء الخلية، وتوصيل تسلسل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي (RNA) إلى الخلايا بسلاسة.
طرق توصيل الأدوية الجينية
تنقسم طرق توصيل الجينات الشائعة الحالية بشكل أساسي إلى فئتين: توصيل النواقل الفيروسية وتوصيل النواقل غير الفيروسية-. يشتمل توصيل الناقلات الفيروسية بشكل أساسي على الفيروسات المرتبطة بالفيروسات الغدية- (AAV) والفيروسات البطيئة، وما إلى ذلك، والتي يمكنها محاكاة عملية الإصابة بالفيروسات في الخلايا المضيفة وعبور حواجز الخلايا بسهولة، وبالتالي تحقيق كفاءة توصيل عالية. ومع ذلك، فإن توصيل النواقل الفيروسية يواجه أيضًا مشاكل: أولاً، لديه قدرة تعبئة محدودة، مثل قدرة التغليف القصوى لـ AAV هي 4.7 كيلو بايت، والتي لا يمكنها توصيل تسلسلات جينية أطول؛ ثانياً، قد تسبب النواقل الفيروسية تفاعلات مناعية خطيرة، بما في ذلك المناعة الخلوية والمناعة الخلطية، مما يشكل مخاطر على التطبيقات السريرية. بالمقارنة مع ذلك،-تتمتع النواقل غير الفيروسية بمزايا كبيرة من حيث السلامة وقدرة تحميل الدواء.
تشتمل النواقل غير الفيروسية الشائعة الاستخدام حاليًا بشكل أساسي على الجسيمات الشحمية والبوليمرات والجسيمات النانوية والإكسوسومات وما إلى ذلك، ومن بينها الجسيمات الشحمية عبارة عن حويصلات مكونة من جزيئات أمفيفيلية بأقطار تتراوح من 100 نانومتر إلى 1 ميكرومتر. وهي تتكون بشكل أساسي من الدهون الفوسفاتية والكوليسترول والدهون PEG والدهون الكاتيونية. يشبه هيكل طبقة ثنائية الفسفوليبيد أغشية الخلايا ويمكنه دخول الخلايا بسلاسة من خلال الالتقام الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للجسيمات الشحمية أيضًا تعديل PEG أو أجسام مضادة محددة على أسطحها للهروب من التصفية المناعية للجسم أثناء استهداف أنسجة أو خلايا معينة. الجسيمات الشحمية الكاتيونية هي جسيمات شحمية تحتوي على دهون ملح الأمونيوم الرباعية موجبة الشحنة، والتي يمكن أن ترتبط بشكل أفضل مع أدوية الحمض النووي سالبة الشحنة وتحافظ على استقرار نظام التوصيل. لذلك، تعد الجسيمات الشحمية إحدى طرق توصيل المتجهات غير الفيروسية الشائعة للأدوية الجينية.
ومع ذلك، فإن الجسيمات الشحمية التقليدية لديها أيضًا بعض المشكلات: أولاً وقبل كل شيء، بسبب النطاق الكبير لأقطار الجسيمات الشحمية، على الرغم من أن هذا يمكن أن يضمن قدرة تحميل كافية للأدوية، عندما تمر الجسيمات الشحمية عبر الفجوة البطانية الوعائية (100-}200 نانومتر)، فإن الحجم الكبير جدًا سيعيق هذه العملية. بالإضافة إلى ذلك، بعد أن تدخل الجسيمات الشحمية الخلايا من خلال الالتقام الخلوي وتشكل نظام الإندوسوم-الليزوزومي، لا تستطيع الجسيمات الشحمية التقليدية إكمال هروب الليزوزوم في الوقت المناسب، مما يؤدي إلى تحلل معظم الأدوية الجينية بواسطة الليزوزومات وعدم قدرتها على ممارسة آثارها. بناءً على أوجه القصور هذه في الجسيمات الشحمية التقليدية في توصيل الأدوية الجينية، تم تطوير الجسيمات الدهنية النانوية (LNP) وأصبحت طريقة توصيل مهمة ومناسبة بشكل خاص لتوصيل الأحماض النووية إلى الخلايا والأنسجة المستهدفة.
مقدمة لنظام الناقل LNP
الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) هي جسيمات نانوية تتكون من مواد تشبه الدهون-ويتراوح قطرها عمومًا بين 10-200 نانومتر. بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية التقليدية، فهي أصغر حجمًا وأسهل في المرور عبر الفجوات البطانية الوعائية. بالإضافة إلى ذلك، يتكون LNP عادة من الدهون الموجبة/المؤينة، والدهون الفوسفاتية المساعدة، ودهون البولي إيثيلين جلايكول (PEG) والكوليسترول. من بينها، يمكن للفوسفوليبيدات المساعدة والكوليسترول أن يزيد من استقرار LNP؛ تساعد دهون PEG على زيادة وقت تداول LNP في الجسم الحي وتقليل التفاعلات المناعية. هذه المكونات لها وظائف مشابهة للجسيمات الشحمية التقليدية. يكمن الاختلاف في الدهون الموجبة/المؤينة، والتي تعد أيضًا المجال الرئيسي لحماية براءات الاختراع لـ LNP.
كما ذكرنا سابقًا، يمكن للجسيمات الشحمية الكاتيونية الحفاظ بشكل فعال على الارتباط بأدوية الحمض النووي وتحسين كفاءة توصيل أدوية الحمض النووي. ومع ذلك، تكون الجسيمات الشحمية الكاتيونية أيضًا عرضة للارتباط غير المحدد- مع بروتينات البلازما سالبة الشحنة وخلايا الدم وما إلى ذلك في الدورة الدموية بالجسم، مما يتسبب في تراكم الجسيمات الشحمية ويتم التخلص منها سريعًا خارج الجسم (نصف-عمر الجسيمات الشحمية الكاتيونية في الجسم الحي هو 15 دقيقة فقط).
ولحل هذه المشكلة، قام الباحثون بتطوير نوع جديد من المواد الدهنية تسمى الدهون القابلة للتأين. الدهون القابلة للتأين تشبه إلى حد كبير الدهون الكاتيونية في البنية. إذا أخذنا الدهون الكاتيونية الشائعة DOTAP والدهون القابلة للتأين DODAP كأمثلة، فإن الفرق هو أن DOTAP عبارة عن ملح أمونيوم رباعي ذو شحنة موجبة، في حين أن DODAP عبارة عن بنية أمين ثالثية. يمكن لبنية الأمين الثلاثي أن تحافظ على pKa للدهون بين 6-7. عندما يكون الرقم الهيدروجيني أقل من pKa (في الظروف الحمضية)، تكون الدهون المتأينة موجبة الشحنة.
عندما يكون الرقم الهيدروجيني قريبًا من pKa (في ظل ظروف محايدة)، تكون الدهون المتأينة محايدة. يمكن لهذا التصميم أن يحل المشكلة التي تواجهها الجسيمات الشحمية الكاتيونية بذكاء: نظرًا لأن الرقم الهيدروجيني في الدورة الدموية قريب من الحياد، فإن الدهون القابلة للتأين تكون محايدة أيضًا، ويتم تقليل الارتباط غير المحدد بينها وبين بروتينات البلازما أو خلايا الدم بشكل كبير، مما يطيل عمر النصف-. بالإضافة إلى ذلك، عندما تلتقط الخلايا الدهون القابلة للتأين LNP وتدخل إلى الليزوزومات، تتأين الدهون وتشحن بشكل إيجابي في البيئة الليزوزومية مع الرقم الهيدروجيني 5-6. يتم دمج الدهون موجبة الشحنة بسهولة مع غشاء الإندوسوم-الليزوزوم، مما يسمح للجسيمات الشحمية بالهروب إلى السيتوبلازم، وفصل وإطلاق الأحماض النووية، وبالتالي ممارسة تأثيراتها. باختصار، يتضمن تصميم نظام الناقل LNP تحسين تكوين الدهون وحجم الجسيمات وشحنة السطح والاستقرار لتحقيق توصيل الجينات بكفاءة.
إستراتيجية التحليل الحيوي LCMS للأدوية الجينية المعبأة LNP-.
تتكون الأدوية الجينية المعبأة LNP- بشكل أساسي من غلاف LNP والدواء الجيني نفسه. تتكون قشرة LNP بشكل أساسي من مكونات دهنية (تمثل الدهون الكاتيونية / القابلة للتأين حوالي 30-50٪، وتمثل الدهون PEG حوالي 2٪، وتمثل الكوليسترول حوالي 20-50٪، وتمثل الدهون الفوسفاتية المساعدة حوالي 10-20٪)، بينما تتكون الأدوية الجينية بشكل أساسي من أجزاء تسلسل الجينات (DNA، ASO، siRNA و miRNA، وما إلى ذلك). وفقًا لأحدث لوائح NMPA وFDA [14-15]، بالنسبة لتطبيق IND لأدوية نظام توصيل الدواء مثل LNP، بالإضافة إلى إجراء الدراسات الدوائية والحركية الدوائية على العنصر النشط (تسلسل الجينات)، يلزم أيضًا تقييم السلامة والصيدلانية لمكونات الدهون الجديدة التي لم يتم استخدامها في الأدوية المسوقة في نظام توصيل الدواء، مثل الدهون الكاتيونية/القابلة للتأين والدهون PEG مع تعديلات خاصة في LNP.
يركز التحليل الحيوي LCMS للدهون LNP على الدهون الموجبة/المؤينة والدهون PEG. نظرًا للاختلافات الهيكلية بينهما، يكون الوزن الجزيئي للدهون الكاتيونية/القابلة للتأين بشكل عام ضمن 1 كيلو دالتون، بينما يمكن أن يصل الوزن الجزيئي للدهون PEG إلى 2 ~ 5 كيلو دالتون بعد حمل مجموعات التعديل، مما يؤدي إلى اختلافات كبيرة في الاحتفاظ الكروماتوغرافي واستجابة قياس الطيف الكتلي بينهما. وبالنظر إلى أن محتوى الدهون الكاتيونية/القابلة للتأين في LNP أعلى من محتوى الدهون PEG، فإن فرق الاستجابة يؤدي إلى عدم القدرة على توحيد طرق المعالجة بشكل فعال (اختيار مذيب الاستخلاص، وتحديد عامل التخفيف) لكليهما. بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لوجود العديد من القمم المتداخلة حول موضع الذروة للدهون PEG، غالبًا ما يكون التدرج الأطول لفصل الطور السائل مطلوبًا للفصل الفعال، وهو ما لا يضمن كفاءة تحليل عالية. لذلك، قمنا بإنشاء طريقة PEG للكشف عن الدهون بشكل منفصل في التحليل الحيوي. في الوقت نفسه، تواجه الدهون الموجبة/المؤينة والدهون PEG أيضًا صعوبات شائعة في تطوير الطريقة بسبب مكوناتها الدهنية، مثل ضعف قابلية الذوبان في الماء، وعدم الاستقرار في المصفوفة البيولوجية، وارتباط البروتين بالاسترداد الذي يتجاوز الحد، والتداخل العالي وبقايا دهون PEG، وتغيير ثبات الدهون في مصفوفة العينة الحقيقية وصعوبة الاختيار القياسي الداخلي.
